發(fā)布日期：2017-02-28

IBS科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了迄今為止最小的CRISPR-Cas9家族成員，研究表明它可以通過腺相關(guān)病毒編輯突變致盲基因。

韓國基礎(chǔ)科學(xué)研究所（Institute for Basic Science, IBS），韓國首爾大學(xué)等處的研究人員設(shè)計出了目前最小的CRISPR-Cas9，并通過腺伴隨病毒（AAV）將其遞送到了肌細(xì)胞和小鼠的眼睛里，用以編輯導(dǎo)致失明的基因。

這一研究成果發(fā)表在Nature Communications上，這種CRISPR-Cas9系統(tǒng)源自空腸彎曲桿菌（CjCas9），未來也許會成為一種有效治療一般疾病和“無藥可救”的疾病的新工具。

CRISPR-Cas9紅得發(fā)紫，作為“基因剪刀”蛋白，Cas9需要在導(dǎo)向RNA指引下在精確靶基因位置進(jìn)行切割。CRISPR-Cas9復(fù)合物要想到達(dá)靶標(biāo)DNA，就需要通過質(zhì)?；虿《具f送。IBS基因組工程中心主任KIM Jin Soo解釋說：“AAV是一種在體內(nèi)表達(dá)目標(biāo)基因的有效和安全的載體，已廣泛用于基因治療。”

天然狀態(tài)下，Cas9是細(xì)菌的免疫武器，切割可能損害細(xì)菌的病毒DNA。最常見的CRISPR-Cas9技術(shù)使用的是源自細(xì)菌化膿性鏈球菌的Cas9。然而這個蛋白由1,368個氨基酸組成，體積太大不能通過AAV包裝和遞送。即使科學(xué)家們將其分成兩部分，分別包裝在不同的病毒，也會出現(xiàn)其它的問題，如需要兩倍的病毒量，活性要比完整的Cas9小。金黃色葡萄球菌Cas9也可以用于基因編輯，且體積稍?。?,053個氨基酸），因此它可以通過AAV傳輸，但這種Cas9又沒有足夠的空間可以裝載其它蛋白。

在這項最新研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)CjCas9大小合適，而且高效，這個蛋白有984個氨基酸，可以與多個導(dǎo)向RNAs，還有熒光報告基因一同包裝進(jìn)AAV中。

為了利用細(xì)菌蛋白進(jìn)行基因編輯，研究人員優(yōu)化了這一技術(shù)，他們設(shè)計了一個短的DNA序列，接在緊挨著Cas9靶向的DNA序列，即Protospacer Adjacent Motif（PAM）。每個不同的Cas9需要一個特定的PAM序列，否則就無法結(jié)合，并切割靶標(biāo)DNA序列。此外，研究人員還修改了導(dǎo)向RNA的長度。

完成這種優(yōu)化后，研究人員將新的CRISPR-Cas9復(fù)合體，連同兩個導(dǎo)向RNA和熒光報告蛋白一起包裝到AAV中，朝著小鼠肌肉和眼睛中的突變基因傳遞。他們主要聚焦于涉及年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）的兩個基因，這也是成年人失明的主要原因之一。

一個基因是ADM的常見治療靶標(biāo)，稱為血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF A），另一個基因是激活VEGF A的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子：HIF-1a。后者此前并未被當(dāng)作藥物靶標(biāo)。在這項研究中，研究小組證明CjCas9通過AAV傳遞到了視網(wǎng)膜，可以有效地使小鼠中的Hif-1a和VEGF A失活，并減少脈絡(luò)膜新血管形成（CNV）的面積。

KIM Jin-Soo解釋說：“CjCas9具有高度特異性，不會出現(xiàn)基因組中的脫靶突變。”

來源：生物通